- 慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞中，Polybrene的作用是什么？>>>
Polybrene是常用的助轉(zhuǎn)劑。它是一種帶正電的小分子，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，能顯著提高感染效率。但Polybrene有一定的細(xì)胞毒性，有的細(xì)胞對(duì)polybrene的毒理反應(yīng)明顯，因此比較敏感或容易分化的細(xì)胞都不能用Polybrene。polybrene最常用的工作濃度為4～8μg/ml。
- EGFP/RFP是否能用于活體成像？>>>
可以用，但是EGFP/RFP等生物熒光背景太高，靈敏度低。雖然RFP的穿透性較EGFP強(qiáng)，但高分文章還是建議用Luciferase。
- RAW264.7轉(zhuǎn)染效率低怎么辦？>>>
- raw264.7是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞系,也是常用的炎癥細(xì)胞模型之一。其難培養(yǎng)、難轉(zhuǎn)染、易分化的特點(diǎn)，至今讓很多科研人員頭疼。實(shí)際上像這類型的細(xì)胞，只有選擇了恰當(dāng)?shù)牟《据d體，轉(zhuǎn)染效率都能達(dá)到80%以上，滿足大部分實(shí)驗(yàn)需要。
- rescue實(shí)驗(yàn)怎么設(shè)計(jì)？>>>
- rescue實(shí)驗(yàn)，也就是常說(shuō)的回復(fù)實(shí)驗(yàn)，有表型上的rescue實(shí)驗(yàn)，但更多地是機(jī)制上的rescue。具體一點(diǎn)也就是說(shuō)，假設(shè)已經(jīng)做了X基因的干擾實(shí)驗(yàn)，造成Y基因下調(diào)，原信號(hào)通路的被抑制。editor說(shuō)不嚴(yán)謹(jǐn)，需要做一個(gè)rescue的實(shí)驗(yàn)。那么就需要過(guò)表達(dá)X基因，回復(fù)X基因的干擾的影響，從而造成Y基因上調(diào)，原信號(hào)通路的激活。
- microRNA的一般研究思路是什么？>>>
1. 芯片篩選出可能跟功能表型相關(guān)的microRNA
2.QPCR驗(yàn)證芯片結(jié)果，選擇感興趣的microRNA
3.過(guò)表達(dá)、抑制感興趣的microRNA
4.尋找microRNA的靶基因
5.luciferase雙熒光素酶靶基因驗(yàn)證
6.rescue回復(fù)實(shí)驗(yàn)
- 如果要在同一個(gè)載體上表達(dá)兩個(gè)基因，應(yīng)該怎么設(shè)計(jì)載體？>>>
- 想要將兩個(gè)蛋白表達(dá)在一個(gè)載體上，除了選擇Promoter A——gene X——Promoter B——gene Y這樣的結(jié)構(gòu)外，還可以用2A或者IRES來(lái)連接兩個(gè)目的蛋白，達(dá)到共同表達(dá)兩個(gè)蛋白的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹．?dāng)然，如果基因太大，則最好是分開(kāi)成兩個(gè)載體。
- 病毒產(chǎn)品的安全性如何？>>>
使用病毒載體的危險(xiǎn)性主要有以下幾個(gè)考慮因素：
1)是否能重組產(chǎn)生致病性病毒;
2)是否具備復(fù)制能力;
3)是否能整合，并導(dǎo)致癌基因激活或者抑癌基因失活;
4)免疫原性。
我們所使用的病毒載體，全部經(jīng)過(guò)改造，去除了致病性元件和復(fù)制功能區(qū)，因此重組產(chǎn)生功能性病毒的概率極低。雖然慢病毒具有整合能力，但是我們?nèi)コ似?span>3’LTR內(nèi)的激活元件，排除了其激活下游基因的能力。因此，這些病毒載體用于體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)使用者而言都具有極高的安全性。盡管如此，我們建議，使用病毒載體進(jìn)行細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要遵循標(biāo)準(zhǔn)廢棄病毒載體操作流程。
一部分病毒(腺病毒和腺相關(guān)病毒載體)，其整合幾率低，因此安全性高。有的病毒載體，比如腺相關(guān)病毒載體，目前被認(rèn)為是安全性非常高的一類基因治療載體，應(yīng)用前景非常樂(lè)觀。
- 什么情況下應(yīng)該選用腺病毒載體？>>>
- 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如貼壁不好的細(xì)胞，原代細(xì)胞，或者體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
- 不同組織適合那些血清型的腺相關(guān)病毒？>>>
AAV2/1 肌肉，心臟，骨骼肌（包括心肌），神經(jīng)組織
AAV2/2 中樞神經(jīng)，肌肉，肝臟，腦組織，眼，
AAV2/3 肌肉，肝臟，肺，眼
AAV2/4 中樞神經(jīng)，肌肉，眼，腦
AAV2/5 肺，眼，中樞神經(jīng)，關(guān)節(jié)滑膜，胰腺
AAV2/6 肺，心臟
AAV2/7 肌肉，肝臟
AAV2/8 肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉
AAV2/9 心臟，肌肉，肺（肺泡），肝臟，中樞神經(jīng)
AAV2/DJ 肝臟，視網(wǎng)膜，肺，腎臟
AAV2/DJ/8 肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉
AAV2/Rh10 肺, 心臟，肌肉，中樞神經(jīng)，肝臟
